細胞培養知識（一）

1 冷凍管應如何解凍？ 
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 

2 細胞冷凍管解凍培養時(shí)， 是否應馬上去除DMSO？ 
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無(wú)法生長(cháng)或貼附之問(wèn)題。 

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？ 
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無(wú)法立即適應， 造成細胞無(wú)法存活。 

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類(lèi)？ 
不能。血清是細胞培養上一個(gè)極為重要的營(yíng)養來(lái)源， 所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對于細胞的生長(cháng)會(huì )產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會(huì )造成細胞無(wú)法存活。 

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。
 
6 培養細胞時(shí)應使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？ 
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時(shí)應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細胞培養時(shí)應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時(shí)須更換培養基？ 
視細胞生長(cháng)密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養基即可。
 
8 培養基中是否須添加抗生素？ 
除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態(tài)下， 培養基中不應添加任何抗生素。
 
9 附著(zhù)性細胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于-20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會(huì )。 

10 懸浮性細胞應如何繼代處理？ 
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時(shí)， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。 

11 欲將一般動(dòng)物細胞離心下來(lái)，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動(dòng)物細胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉速， 將造成細胞死亡。 

12 細胞之接種密度為何？ 
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無(wú)法生長(cháng)之一重要原因。 

13 細胞冷凍培養基之成份為何？ 
動(dòng)物細胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來(lái)細胞生長(cháng)用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì )放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。 

14 DMSO 之等級和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？ 
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無(wú)菌狀況， *次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會(huì )。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。 

15 冷凍保存細胞之方法？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ （-20 °C30 分鐘*） → -80 °C 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(cháng)期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(cháng)期儲存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 

16 細胞欲冷凍保存時(shí)， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
 冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

17 應如何避免細胞污染？ 
細胞污染的種類(lèi)可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無(wú)菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來(lái)源和培養基配制是減低污染之方法。 

18 如果細胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應如何處理？ 
直接滅菌后丟棄之。 

19 支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀(guān)察出異狀？ 
不能。除極有經(jīng)驗之專(zhuān)家外，大多數遭受支原體污染的細胞株， 無(wú)法以其外觀(guān)分辨之。 

20 支原體污染會(huì )對細胞培養有何影響？ 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長(cháng)參數， 代謝及研究之任一數據。故進(jìn)行實(shí)驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實(shí)驗結果之數據方有意義。 

21 偵測出細胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。 

22 CO2 培養箱之水盤(pán)如何保持清潔？ 
定期（至少每?jì)芍芤淮?/span>） 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。 

23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會(huì )偏暗紅色， 且pH值會(huì )越來(lái)越偏堿性？ 
培養基保存于4 °C 冰箱中， 培養基內之CO2 會(huì )逐漸溢出，造成培養基越來(lái)越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會(huì )隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長(cháng)停滯或死亡。若培養基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調整pH 值。 

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？ 
不同廠(chǎng)牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠(chǎng)牌不同之dish 或flask 而有顯著(zhù)之生長(cháng)差異。 

25 購買(mǎi)之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì )發(fā)生細胞數目太少之情形？ 
研究人員在冷凍細胞之培養時(shí)出現細胞數目太少， 大都是因為離心過(guò)程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長(cháng)隔夜后再更換培養基即可。 

26 購買(mǎi)之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 
研究人員在細胞培養時(shí)出現存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80 °C 太久。 

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時(shí)用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。