細胞培養的條件一般離不開(kāi)這5個(gè):合適的細胞培養基、優(yōu)質(zhì)血清、無(wú)菌無(wú)毒細胞培養環(huán)境、恒定的細胞生長(cháng)溫度、合適的氣體環(huán)境
絕大部分細胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后,殘留的那些無(wú)法計算體積的附著(zhù)在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞(絕大部分1min不到)。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞,連續這樣傳代,對細胞傷害很大。
不是細胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了,一般你肉眼觀(guān)察貼壁細胞層,只要能移動(dòng)了,多半呈沙壯移動(dòng),其實(shí)已經(jīng)可以了,很多人喜歡把細胞消化或者吹打成*分離細胞,這是沒(méi)有必要的。一般能移動(dòng)了,說(shuō)明細胞與培養基質(zhì)材料的附著(zhù)已經(jīng)消失了,細胞之間的附著(zhù)也已經(jīng)消失了,細胞已經(jīng)獨立分布了(雖然沒(méi)有呈現很廣的離散分布)。這個(gè)時(shí)候應該停止消化,不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。
細胞就是*成單個(gè)細胞懸液,之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì )聚集,這個(gè)是貼壁培養的細胞,尤其是腫瘤細胞的一個(gè)特性,無(wú)論死活的細胞都是如此,你可以嘗試,準備100%的單個(gè)細胞懸液,貼壁后觀(guān)察細胞,仍然是幾個(gè)幾個(gè)細胞聚集在一起。一些懸浮培養細胞也是如此,容易聚集,不要去嘗試過(guò)幾個(gè)小時(shí)就拿出來(lái)吹打成單細胞懸液(不要笑,這個(gè)是初養懸浮細胞的人常犯的錯誤,以為懸浮培養就是一個(gè)一個(gè)分開(kāi))。細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來(lái),這個(gè)時(shí)候即使是成片的(比如Calu-3細胞),吹打不超過(guò)20次后(一般10次即可),成小規模聚集(10個(gè)細胞左右),是正常的,不要試圖再去延長(cháng)消化時(shí)間,或者象有的同學(xué)那樣吹打1h,等待單細胞懸液出現。
比較難消化的細胞(潤洗方法5min還不能消化),就以coloncancer為例,比如HCT15,LS411和KM12,這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100mmdish,一次多加入500ul,就足夠了,一般我加300ul。即使這樣難消化的細胞,一般不超過(guò)5min,即可見(jiàn)細胞成片移動(dòng),就應該停止消化。一些正常細胞也會(huì )有難消化的時(shí)候,比如tsDC細胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。